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　　由动物或植物的可食或非可食部分直接提取，或由传统或通过基因修饰的微生物（包括但不限于细菌、放线菌、真菌菌种）发酵、提取、纯化、制剂等工艺制得，用于食品加工，具有特殊催化活性的制剂产品。

　　注：商品化的酶制剂产品可含有一个或多个活性酶组分，为产品活性保存、流通贮存、标准化使用，允许加入食

　　通过载体利用物理和/或化学的方法，使酶制剂在食品生产过程中以不可溶解状态发挥作用的产品形态。

　　4.1.1用于生产酶制剂的原料必须符合良好生产规范或相关要求，在正常使用条件下不应对最终食品产生有害健康的残留污染。

　　注：本标准附录B给出的酶活力测定方法供参考。企业可按相应标准中给出的或企业规定的方法测定。

　　A.2酶制剂中一般按生产需要适量使用，但在酶制剂使用的终产品中残留量应符合GB2760的规定；特殊要求见表A.1备注。

　　可以与α-乙酰乳酸反应脱羧，将α-乙酰乳酸羧基转化为3-羟基-2-丁酮的酶。

　　在30℃、pH6.0的条件下，1g或1mL酶样品与底物α-乙酰乳酸起反应，每分钟生成1μmol的3-羟基-2-丁酮（乙偶姻），即为1个酶活力单位，以U/g（或U/mL）表示。

　　本方法适用于用分光光度计测定α-乙酰乳酸脱羧酶制剂中α-乙酰乳酸脱羧酶的酶活力。本方法不适用于啤酒和其他含醇产品中α-乙酰乳酸脱羧酶的酶活力的测定。

　　乙偶姻在贮存时易形成二聚体，从而影响试验结果。但若遵循配制步骤中所述的措施去预防，本方法仍可使用。

　　α-乙酰乳酸脱羧酶与底物α-乙酰乳酸反应脱羧生成乙偶姻。乙偶姻在碱性条件下与萘酚和肌酸的混合物反应生成红色产物。通过在522nm下测定溶液的吸光度，可以从乙偶姻标准曲线上得出反应生成的乙偶姻的量，进而计算出α-乙酰乳酸脱羧酶的酶活力。

　　B.2.3.3.2α-乙酰乳酸底物（2.00mL/L）：吸取乙基－2－乙酸基－2－甲基乙酰乙酸100μL于50mL容量瓶中，加入约0.50mol/L的氢氧化钠溶液6.0mL，搅拌20min后，加入缓冲液到约40.0mL；用约1mol/L盐酸调节溶液的pH到6.00±0.05。然后，再用缓冲液定容。该溶液使用前配制。

　　B.2.3.3.3萘酚（10.0g/L）/肌酸（1.0g/L）显色剂：分别称取1－萘酚5.0g和肌酸0.5g移入500mL容量瓶中，用约1mol/L的氢氧化钠溶液溶解并定容。该溶液使用前配制。配制时需避光，并且冰

　　警告：1－萘酚可燃，有毒。对眼和粘膜有刺激性。吞咽或经皮肤吸收都能引起中毒。

　　B.2.3.3.4乙偶姻(3－羟基－2－丁酮)储备液（1.000g/L）：取一定量的乙偶姻于试管中，在37℃恒温箱中米乐-官方网站入口溶解。然后将试管置于冰水中使乙偶姻重结晶。重结晶后，乙偶姻不含有影响试验结果的乙偶姻二聚体，可用于储备液的配制；称取重结晶后的乙偶姻0.100g，精确至0.0001g，移入100mL容量瓶中，用水溶解并定容。

　　注：乙偶姻对热不稳定，且容易吸潮，因此应放置在干燥器中冷藏（2℃~6℃)保存。如发现物质有明显的

　　乙偶姻标准溶液，用乙偶姻储备液和水按照表B.2稀释而成，该溶液应每天配制。表B.2乙偶姻标准溶液

　　分别吸取配制好的乙偶姻标准溶液400μL（表B.2）到10mL的试管中。然后，依次在每个试管中加入显色剂4.60mL，用漩涡震荡器充分混合均匀。置于室温，并开始计时。

　　反应40.0min后，使用分光光度计，在522nm下测定各管溶液的吸光度。B.2.3.5.2标准对照品的制备

　　在每次分析中,将该标准对照品与样品一同进行检测，以判断试验的重复性。B.2.3.5.3样品溶液的制备

　　从样品中称取一定量的试料，精确至0.0005g，用溶液稀释。其稀释的倍数要使样品的最终吸光度H1落在乙偶姻标准曲线标准曲线nm波长下的吸光度为Y轴，乙偶姻的浓度（mg/L）为X轴，绘制标准曲线，计算出标准曲线的斜率h(或用回归方程计算)。

　　将试样溶液和底物先置于30℃水浴中预热约10min，然后，按下述方法处理每一个试样溶液：

　　a)样品吸光度值H1：吸取酶样品溶液200.0μL于30℃±0.1℃水浴中的10mL试管里，然后加入预热好的底物200.0μL，用漩涡震荡器充分混匀，迅速放回到水浴中，并开始计时。

　　c)反应20.0min后，依次向每支试管中加入显色剂4.60mL，用漩涡震荡器充分混匀。置于室温，重新开始计时。

　　d)反应40.0min后，使用分光光度计，在522nm波长下测定各管溶液的吸光度。

　　α-乙酰乳酸脱羧酶制剂的酶活力X1，单位为U/mL或U/g，按式（B.1）计算：

　　0.0011351——0.1g的乙偶姻所对应的摩尔数；F1——样品溶液反应前的总稀释倍数；

　　当结果小于1U/g（或U/mL）时给出1位有效数字；当结果大于等于1U/g（或U/mL）且小于100U/g（或mL）时给出2位有效数字；当结果大于等于100U/g（或U/mL）时给出3位有效数字。

　　试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对

　　本方法适用于用全自动生化分析仪测定α-乙酰乳酸脱羧酶制剂中α-乙酰乳酸脱羧酶的酶活力。本方法不适用于啤酒和其它含醇产品中α-乙酰乳酸脱羧酶酶活力的测定。

　　乙偶姻在贮存时易形成二聚体，从而影响试验结果。但若遵循配制步骤中所述的措施去预防，本方法仍可使用。

　　α-乙酰乳酸脱羧酶与底物α-乙酰乳酸反应脱羧生成乙偶姻。乙偶姻在碱性条件下与萘酚和肌酸的混合物反应生成红色产物。通过在510nm波长下测定标准溶液的吸光度绘制出标准曲线，对照标准曲线进一步计算出酶样品的活力。

　　B.2.4.4.1全自动生化分析仪：要求带有进样系统、搅拌系统、温度控制系统30℃±0.2℃和检测系统。检测系统要求可在510nm波长处，用动力学法检测吸光度变化，时间间隔最少18s。

　　称取一定量的α-乙酰乳酸脱羧酶标准品，精确到0.0005g。用缓冲液溶解并定容至100mL，得到标准储备液。标准品称取的量要使标准储备液中α-乙酰乳酸脱羧酶的酶活力约为0.75U/mL。

　　a)取一定量的乙偶姻于试管中，在37℃的恒温箱中溶解。然后将试管置于冰水中使乙偶姻重结晶。

　　b)称取0.197g重结晶后的乙偶姻，精确到0.0001g，用缓冲液B.3.1溶解并定容至200mL，得到标准对照品储备液。然后再用相同的缓冲液稀释20倍备用。

　　标准对照品储备液在4℃~8℃并且避光的条件下的保存期为一周。B.2.4.5.3样品溶液的制备

　　从样品中称取一定量的试料，用缓冲液溶解稀释。稀释的倍数要使得最终稀释液的酶活力在27.5mU/mL～62.5mU/mL范围内。

　　用参数Logit-Log法计算出标准曲线。其中Y轴单位为OD/min，X轴单位为标准点的酶活力mU/mL。B.2.4.6.2样品活力的计算

　　α-乙酰乳酸脱羧酶制剂的酶活力X2，单位为U/mL或U/g，按式（B.2）计算：

　　A1——由标准曲线得出的样品最终稀释液的活力，单位为mU/mL；F2——溶解样品用的容量瓶的体积，单位为毫升（mL）；

　　m——试料的质量的数值，单位为克（g）；1000——mU到U的单位转换因子。

　　样品的测定结果用算术平均值表示。当标准对照品稀释液的实验值在0.48mU/mL～0.52mU/mL时，样品的实验结果有效，可计算平均值。否则，应重新进行试验。

　　当结果小于1U/g（或mL）时给出1位有效数字；当结果大于等于1U/g（或mL）且小于100U/g（或mL）时给出2位有效数字；当结果大于等于100U/g（或mL）时给出3位有效数字。当结果小于0.6U/g（或mL）时，表示为＜0.6U/g（或mL）。

　　试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的4%。

　　在50℃、pH3.5的反应条件下，1g固体酶粉（或1mL液体酶），1h分解果胶产生1mg半乳糖醛酸，即为1个酶活力单位，以U/g或U/mL表示。

　　果胶酶能水解果胶，生成的半乳糖醛酸的还原性糖醛基可用次亚碘酸法定量测定，以此来表示果胶酶的活力。

　　本方法主要用于检测果胶酶产品中多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶的活力，对于果胶酶中的果胶（甲基）酯酶不适用。

　　B.3.4.110g/L柑橘果胶溶液：称取果胶粉1.0000g（SigmaP9135或相当，精确至0.1mg），加水溶解，煮沸，冷却，过滤。调整pH至3.5，用水定容至100mL，冰箱储存备用。使用时间不超过3天。

　　注：果胶底物对实验的影响大。如使用不同来源或批号的果胶粉，应与旧批次进行对照试验。

　　B.3.4.52mol/L硫酸溶液：取浓硫酸5.6mL，缓慢加入适量水中，冷却后用水定容至100mL，摇匀，备用。

　　用已知质量的50mL烧杯，称取1g～2g酶粉（精确至0.0001g）或准确吸取1.00mL，用少量柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液充分溶解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量上述缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液待用。

　　注：待测酶液需准确稀释至一定倍数，酶液浓度控制在消耗硫代硫酸钠标准溶液与空白消耗之差在0.5mL～1.0

　　——于甲、乙两支比色管中，分别加入5mL果胶溶液，置于50℃±0.2℃恒温水浴中预热8min；——向甲管（空白）加入5mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液；向乙管（样品）中加入1mL稀释酶液和

　　4mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，立即摇匀，计时，准确反应30min后，立即取出，加热煮沸5min终止反应，冷却；

　　——取上述甲、乙管反应液各5mL放入碘量瓶中，准确加入4mL碳酸钠标准溶液和5mL碘标准溶液，摇匀，于暗处放置20min；

　　——取出，加入2mL硫酸溶液，用硫代硫酸钠标准溶液滴定至浅黄色，加淀粉指示液3滴，继续滴定至蓝色刚好消失为其终点，记录甲管、乙管反应液消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积。同时做平行样品测定。

　　A2——空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，单位为毫升（mL）；B1——样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积，单位为毫升（mL）；

　　C1——硫代硫酸钠标准溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；0.51——1mmol硫代硫酸钠相当于0.51mmol的游离半乳糖醛酸；

　　5——滴定时取反应混合物的总体积，单位为毫升（mL）；1——反应时加入稀释酶液的体积，单位为毫升（mL）；

　　试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的3%。

　　以淀粉为底物，在一定条件下从淀粉的非还原性末端开始依次水解α-1,4、α-1,6、α-1,3葡萄糖苷键产生葡萄糖的淀粉葡萄糖苷酶。

　　1mL酶液或1g酶粉在40℃、pH4.6的条件下，1h水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为一个酶活力单位，以U/mL（或U/g）表示。

　　B.4.3.52mol/L硫酸溶液：吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)5.6mL缓缓加入适量水中，冷却后，用水定容至100mL，摇匀。

　　B.4.3.6200g/L氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠20g，用水溶解，并定容至100mL。

　　B.4.3.720g/L可溶性淀粉溶液：称取可溶性淀粉(2±0.001)g，然后用少量水调匀，缓缓倾入已沸腾的水中，煮沸、搅拌直至透明，冷却，用水定容至100mL。此溶液需当天配制。

　　B.4.5.1.1液体酶：使用连续多档分配器准确吸取适量酶样，移入容量瓶中，用缓冲溶液稀释至刻度，充分摇匀，待测。

　　B.4.5.1.2固体酶：用50mL小烧杯准确称取适量酶样，精确至1mg，用少量乙酸—乙酸钠缓冲溶液溶解，并用玻璃棒仔细捣研，将上层清液小心倾入适当的容量瓶中，在沉渣中再加入少量缓冲溶液，如此反复捣研3次～4次，取上清米乐-官方网站入口液，最后全部移入容量瓶中,用缓冲溶液定容，磁力搅拌30min以充分混匀，取上清液测定。

　　注：1.制备待测酶液时，样液浓度应控制在滴定空白和样品时消耗0.05mol/L硫代硫酸钠标准滴定溶液的差

　　取A、B两支50mL比色管,分别加入可溶性淀粉溶液25mL和乙酸—乙酸钠缓冲溶液5mL，摇匀。于40℃土0.2℃的恒温水浴中预热5min～10min。在B管中加入待测酶液2.0mL，立即记时，摇匀。在此温度下准确反应30min后，立即向A、B两管中各加氢氧化钠溶液0.2mL，摇匀，同时将两管取出，迅速用水冷却，并于A管中补加待测酶液2.0mL(作为空白对照)。

　　吸取上述A、B两管中的反应液各5.0mL，分别于两个碘量瓶中，准确加入碘标准溶液10.0mL，再加氢氧化钠溶液15mL，边加边摇匀，并于暗处放置15min，取出。用水淋洗瓶盖，加入硫酸溶液2mL，用硫代硫酸钠标准滴定溶液滴定蓝紫色溶液，直至刚好无色为其终点，分别记录空白和样品消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积(A、B)。

　　葡糖淀粉酶制剂的酶活力X4，单位为U/mL或U/g计，按式（B.4）计算：

　　A3——滴定空白时,消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（mL）；B2——滴定样品时,消耗硫代硫酸钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（mL）；C2——硫代硫酸钠标准滴定溶液的准确浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；

　　90.05——与1.00mL硫代硫酸钠标准溶液相当的葡萄糖的摩尔质量，g/mol(M=90.05)；32.2——反应液的总体积，单位为毫升（mL）；

　　试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的10%。

　　可水解麦芽糖分子及直链麦芽糊精中α-1,4-糖苷链，同时将游离出来的葡萄糖残基转移到一个葡萄糖分子或麦芽糖、麦芽三糖分子上，形成α-1,6链，生成键异麦芽糖、潘糖、异麦芽三糖等含α-1键的寡糖的酶。

　　在40℃、pH5.0的条件下，1mL酶样品与底物α-甲基-D-葡萄糖苷起反应，60min生成1μg的葡萄糖，即为1个酶活力单位，以U/mL或U/g表示。

　　转葡糖苷酶作用于底物α-甲基-D-葡萄糖苷，生成的葡萄糖与含有葡萄糖氧化酶、过氧化酶的4-氨基安替比林和酚试剂进行显色反应定量测定。

　　mL（试剂A）；将乙酸钠溶液（B.5.4.2）20mL溶于水，稀释至100mL（试剂B）；将A和B混合，调pH至5.0。

　　B.5.4.74-氨基安替比林-苯酚显色剂：在Tris-磷酸缓冲液40mL中，加入葡萄糖氧化酶（5mg葡萄糖氧化酶“Amano”）550U和过氧化物酶（0.76mg，165U/mg的过氧化物酶“Amano”）125U，再

　　加入4-氨基安替比林溶液1mL和苯酚溶液1.4mL，用Tris-磷酸缓冲液稀释至50mL（随配随用）。

　　B.5.4.8底物溶液：将α-甲基葡萄糖（C7H14O6）2.0g溶解于水50mL中，用水稀释至100mL（5℃~15℃可稳定两周）。

　　称取1g酶样，精确至±0.0001g或吸取酶样1mL，精确至0.01mL，加到适当大小的容量瓶中，用经冷却的水稀释至刻度，混匀。

　　注：配制的样品溶液使其0.5mL的A60～A0介于0.15～0.32之间。

　　吸取底物溶液1mL和0.02mol/L乙酸-乙酸钠溶液1mL加入15mm×150mm的试管中，在40℃±0.5℃的恒温水浴箱中保温10min。加入样品溶液0.5mL，混匀，于40℃±0.5℃的恒温水浴箱中准确保温60min后，将试管转移至沸水浴中加热5min，然后用流水快速冷却。冷却后，吸取此溶液0.1mL到试管中，并加入4-氨基安替比林-苯酚显色剂3mL，混匀。将此试管放入40℃±0.5℃的恒温水浴箱中，保温20min，测定500nm处的吸光度A60。

　　空白对照：吸取0.02mol/L乙酸-乙酸钠溶液1mL和样品溶液0.5mL加入15mm×150mm的试管中，混匀。将试管转移至沸水浴中加热5min，然后用流水快速冷却。冷却后，加入底物溶液1mL，混匀。吸取此溶液0.1mL到空试管中，加入4-氨基安替比林-苯酚显色剂3mL，混匀。将此试管放入40℃±0.5℃的恒温水浴箱中，保温20min，测定500nm处的

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