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　　酶作为天然生物催化剂，以其催化高效、特异性强、反应条件温和及生理毒性低等优点，被誉为绿色生物制造的“芯片”。然而，在复杂严苛的工业操作环境中，游离酶难以维持其活性构象，这大大降低了工业酶的催化效率，并且限制了其在工业催化领域的应用。固定化酶技术通过稳定酶的空间构象来解决这一问题，其中共价有机框架（COF）因其结构可调性、化学稳定性和高比表面积而成为理想的酶固定化载体材料。尽管如此，固定化后酶的催化环境不适配问题仍然限制了其催化活性和稳定性。

　　为固定化酶提供适配的微环境极为关键，这不仅使酶能在最优条件下工作，还能保护酶不受恶劣外界环境的侵扰。共价有机框架（COFs）的可调配体和可修改官能团，为定制这种微环境提供了良好的基础。如图1所示，作者首先利用常温超声波合成法，制备了含酚羟基的COF材料（COF-TATP），随后通过氯乙酸钠进行羧甲基化改性，制得含羧基官能团的COF材料（cmCOF-TATP）。接着，采用物理吸附方法将细胞色素c（Cyt c）固定于cmCOF-TATP上，制备出酶-COF复合物（Cyt c@cmCOF-TATP）。最后，通过形貌结构表征等技术手段，验证了Cyt c@cmCOF-TATP的成功合成（略）。

　　进一步地，作者利用分子动力学模拟，追踪指定原子N (His 18)、S (Met 80)、C (Pro 30)的相对距离变化，观察了不同pH条件下酶活性位点的结构变化，以探究Cyt c@cmCOF-TATP活性增强的机制。研究结果显示，在pH 4.0条件下，Cyt c@cmCOF-TATP活性位点残基侧链的RMSD值最小（见图3a），这可能是由于在低pH环境中Cyt c与cmCOF-TATP之间的相互作用加强，导致吸附强度增加。图3b-c展示了活性位点残基对距离的概率分布图。在pH 4.0的环境中，Cyt c@cmCOF-TATP中这三组原子的距离均表现出更短的趋势，这说明活性位点区域变得更加紧凑。结合实验数据，作者推断活性位点区域的紧密度增加可能有助于提升酶活性，这一效果可能源自Cyt c和cmCOF-TATP之间强化的相互作用，从而稳定了整个框架及活性位点的结构。

　　最后，作者对催化稳定性进行了测试。经过六次循环后，Cyt c@COF-TATP仅保持了72.8%的初始活性，而Cyt c@cmCOF-TATP的活性保持率提高至83.7%，较之前增加了10%以上，从而增强了固定化Cyt c的循环稳定性。这种提升可能源于羧基与酶分子之间更强的相互作用，有效减少了酶的泄漏。此外，在四种有机溶剂处理后，游离Cyt c的酶活损失均超过45%，而Cyt c@cmCOF-TATP在四氢呋喃和丙酮中能保持90%以上的活性，在乙醇和二甲基亚砜中也能保持65%以上的活性，表明COF孔道内羧基基团的引入有效保护了Cyt c的活性构象不受有机溶剂的干扰。

　　综上所述，本研究通过羧甲基化改性方法，成功将羧基官能团集成于COFs的孔隙中，提供了与游离酶适配的微环境条件，从而显著提升了固定化Cyt c的催化效率。羧甲基化的cmCOF-TATP还显著提高了其循环稳定性和对有机溶剂的耐受性，在广泛的pH范围内维持较高活性。通过精准调控COF孔隙微环境，羧甲基化改造的cmCOF-TATP载体材料在酶固定化领域展现出巨大潜力，为开发具有卓越性能的酶@COF催化剂提供了一种有效的化学改造策略。

　　李致贤，副教授，硕士生导师。2016年毕业于清华大学化学工程系，获得博士学位，师从欧阳平凯院士和刘铮教授。研究领域涵盖固定化酶、人工酶的构建及其应用，在ACS Catalysis等期刊发表SCI论文40余篇。

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